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本制品是一种由高质量的次氮基三乙酸(NTA)共价偶联至琼脂糖凝胶，再通过NTA的4个结合位点螯合三价铁离子(Fe³⁺)制备而成的琼脂糖凝胶。本制品可特异性地与动植物或者微生物裂解液、血清、腹水、蛋白消化液、冻干多肽等样品中磷酸化多肽结合，从而用于磷酸化多肽或磷酸化多肽复合物的纯化。

本制品基于固定化金属离子亲和层析(IMAC)技术研发而成。研究发现，二价金属离子如铜离子、锌离子和镍离子可用于His-tag蛋白的分离纯化，而三价铁离子和四价钛离子可用于磷酸化蛋白和磷酸化多肽的富集和纯化。

本制品的NTA-Fe琼脂糖凝胶能高效且快速地进行磷酸化多肽的富集和纯化，多肽纯化步骤简便，纯化条件温和，且多肽纯化后可直接进行下游实验。磷酸化多肽纯化琼脂糖凝胶(NTA-Fe)可特异性地结合磷酸化多肽，并可以借助离心机等分离设备非常便捷地应用于磷酸化多肽或其多肽复合物的纯化或免疫沉淀等实验。

磷酸化蛋白是研究最多的一种蛋白质翻译后修饰，蛋白质的磷酸化和去磷酸化对生物体的众多生命活动起着至关重要的作用。质谱分析可精确鉴定蛋白质中发生的磷酸化修饰，并定位到具体的氨基酸残基，是磷酸化蛋白组学研究的核心技术。在进行质谱分析前，需要将蛋白质直接酶解成片段，但是这样的操作不仅增加了样品的复杂度，并且由于酶解后大量非磷酸化肽段抑制磷酸化肽段的质谱信号从而降低了磷酸化肽段的质谱检测灵敏度。因此，在质谱分析前对磷酸化蛋白或多肽进行有效的分离富集非常重要。

• 稳定性高、特异性强、靶多肽结合量高：与国内外大多数的同类产品相比，本制品铁离子配基密度较高，铁离子脱落程度低，对磷酸化多肽的结合具有很强的特异性。本制品每毫升 悬浊液含约50%琼脂糖凝胶沉淀，含有不少于30μmol/mL的NTA-Fe³⁺，通常每毫升 琼脂糖凝胶沉淀可结合＞8mg磷酸化多肽，具体的最大结合量和磷酸化多肽的分子量大小等相关。
  
• 结合目的多肽速度快：本制品使用了NTA螯合的铁离子，粒径在90μm左右。通常30分钟内即可完成磷酸化多肽吸附的过程，60分钟内完成目的多肽的纯化操作。缩短操作时间可以有效避免在长时间操作过程中目的多肽的降解或变性，充分保证目的多肽的活性。
  
• 可高效洗脱磷酸化多肽：本制品根据磷酸化多肽的结构、生物学功能及后续应用的要求等，使用氨水进行多次洗脱。洗脱时间短，洗脱效率高。
  
• 使用便捷：本制品储存在特殊保护液中，不含甘油，可以通过离心机等设备实现快速高效的分离。

本制品每毫升 悬浊液中共含约0.5mL琼脂糖凝胶沉淀。本制品标注的体积为悬浊液总体积。每毫升 悬浊液可以用于纯化约4mg磷酸化多肽。磷酸化多肽分子量的大小会影响本制品可以纯化的目的多肽的mg数。

• 本NTA-Fe琼脂糖凝胶经测试，冻融3次不影响效价，但仍建议适当分装减少冻融次数。频繁使用建议4℃保存。
  
• 推荐纯化的磷酸化多肽来自冻干的多肽，且不含有变性剂和盐类，同时使用Binding/Wash Buffer溶解冻干的磷酸化多肽以获得最优的纯化效果。
  
• 本制品纯化时不可以使用磷酸盐类缓冲液，以免和磷酸化多肽形成竞争结合，从而降低磷酸化多肽的载量。
  
• 本制品使用前要适当充分重悬，即颠倒若干次使琼脂糖凝胶混合均匀，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免琼脂糖凝胶破碎等。
  
• 本制品含有微量的防腐剂，使用前宜先用TBS等适当溶液洗涤凝胶3次，以充分消除防腐剂可能产生的干扰。
  
• 本制品使用过程中，缓冲试剂如Tris、HEPES、MOPS等的浓度不宜超过100mM，Triton、Tween、NP-40的浓度不宜超过2%，脱氧胆酸钠、CHAPS的浓度不宜超过1%。其它未提及试剂的兼容性可以参考上述试剂，但有待实验验证。
  
• 在纯化或免疫沉淀时，建议设置阳性和阴性对照组。
  
• 多肽样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4℃或冰浴，以减缓多肽降解或变性。为有效抑制多肽降解，可以在多肽样品中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，但不要添加EDTA。例如通用型蛋白酶抑制剂混合物、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(质谱兼容)、哺乳动物样品专用蛋白酶抑制剂混合物、哺乳动物样品专用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物等。
  
• 如果离心不能完全除去多肽样品中的不溶物，可以将样品溶液用0.45μm的滤膜过滤。
  
• 如果自行配制裂解液，需注意DTT、TCEP、巯基乙醇和EDTA等对本制品与磷酸化多肽的结合可能有一定影响，但RIPA裂解液(强，无抑制剂)或Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)等都完全适用。

• 缓冲液的准备：
  
  • Binding/Wash Buffer：250mM乙酸，30%乙腈。
    
  • Elution Buffer：150mM NH₄OH。
  • 所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm孔径滤膜过滤，以减少杂质，提高磷酸化多肽纯化效率。
  • 推荐的缓冲液适用于大多数磷酸化多肽的纯化。对于特殊样品，需自行进行适当的优化或参考常见问题。
  • 对于难以洗脱的样品，可以提高Elution Buffer中NH4OH浓度，但不宜超过400mM。
• 样品的制备：
  
  • 使用Binding/Wash Buffer溶解冻干的磷酸化多肽，终浓度为2mg/mL。推荐使用无核酸酶低吸附离心管。
    
    • 为了得到最优的纯化结果，冻干的多肽必须完全溶解在Binding/Wash Buffer里。
  • (选做)使用pH试纸测试磷酸化多肽溶液的pH值，确保pH＜3。
• NTA-Fe琼脂糖凝胶的准备：
  
  • 取琼脂糖凝胶并去除上清。轻轻重悬NTA-Fe琼脂糖凝胶，尽量形成均匀的凝胶悬浊液，按照每4mg目标多肽需要使用1mL琼脂糖凝胶(50%混悬液)的用量，取适量NTA-Fe琼脂糖凝胶至一洁净低吸附离心管中待用。
    
    • 使用大孔径吸头(如用剪刀剪去部分吸头)吸取凝胶悬浊液会比较方便。也可以使用普通离心管，但可能会导致多肽的损失。
  • 洗涤琼脂糖凝胶。加入与原凝胶悬浊液等体积或适当更大体积的Binding/Wash Buffer洗涤凝胶，轻轻重悬NTA-Fe琼脂糖凝胶。600×g在4℃离心5分钟，小心去除上清，不要吸到凝胶，完成一次洗涤步骤。然后再按照前述洗涤步骤，洗涤2次。最终去除上清，并根据后续的实验目的，用适量的适当溶液重悬NTA-Fe琼脂糖凝胶。
• 目标多肽与琼脂糖凝胶结合：
  
  • 加入琼脂糖凝胶与孵育。按照每4mg磷酸化多肽样品，加入1mL琼脂糖凝胶悬浊液的比例加入NTA-Fe琼脂糖凝胶，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育30分钟。
    
    • 如果需要，可以在2～8℃旋转混合1小时，以防止目标多肽降解。
  • 分离。孵育完毕后，600×g在4℃离心5分钟，小心去除上清，避免吸到凝胶。
    
    • 对于上清部分，可适量保存并用于检测纯化的效果。
  • 洗涤。加入1mL的Binding/Wash Buffer，轻轻重悬NTA-Fe琼脂糖凝胶。600×g在4℃离心5分钟，小心去除上清，避免吸到凝胶。重复洗涤3次。再用1mL质谱级水洗涤1次。
• 洗脱：
  
  • 根据目标多肽的浓度及后续实验要求，可以加入0.2～1mL Elution Buffer，轻轻翻转离心管数次，摇床摇动洗脱5分钟，600×g在4℃离心5分钟，收集洗脱液到新的低吸附离心管，即为纯化的磷酸化多肽。
    
  • 如果需要，重复上述步骤2～3次，收集样品到新的低吸附离心管中，还可以得到一些磷酸化多肽。
    
  • 合并洗脱的多肽样品，转移到低吸附离心管，真空蒸发旋干以用于LC-MS等分析。
    
    • 为了避免凝胶的残留，推荐洗脱液真空旋干前，10000×g离心1分钟取上清；或者推荐使用过柱以避免凝胶干扰LC-MS分析。
  • 使用0.1%甲酸(FA)重悬磷酸化多肽样品以用于LC-MS等分析。